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May 23, 2023

Identificação da idade

Volume de comunicações da natureza

Nature Communications volume 14, Número do artigo: 2836 (2023) Citar este artigo

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Um dos principais eventos na encefalite viral é a capacidade do vírus de entrar no sistema nervoso central (SNC). Vários vírus encefalíticos, incluindo o vírus La Crosse (LACV), induzem principalmente encefalite em crianças, mas não em adultos. Esse fenômeno também é observado em modelos de camundongos LACV, onde o vírus ganha acesso ao SNC de animais recém-desmamados por meio de vazamento vascular de microvasos cerebrais, provavelmente através de células endoteliais capilares cerebrais (BCECs). Para examinar os fatores regulatórios específicos da idade e da região do vazamento vascular, usamos transcriptômica em todo o genoma e triagem de siRNA direcionada para identificar genes cuja supressão afetou a patogênese viral em BCECs. Análises adicionais de dois desses produtos gênicos, Connexin43 (Cx43/Gja1) e EphrinA2 (Efna2), mostraram um efeito substancial na patogênese do LACV. A indução de Cx43 pelo ácido 4-fenilbutírico (4-PBA) inibiu a doença neurológica em camundongos desmamados, enquanto a deficiência de Efna2 aumentou a doença em camundongos adultos. Assim, mostramos que Efna2 e Cx43 expressos por BCECs são os principais mediadores da neuroinvasão induzida por LACV e doenças neurológicas.

O vírus La Crosse (LACV), um vírus de RNA de sentido negativo pertencente à família bunyaviridae1, é uma das principais causas de encefalite arboviral em crianças2. Em adultos, a infecção por LACV geralmente causa uma síndrome febril muito leve3. A maior incidência de doença neurológica em crianças em comparação com adultos sugere diferenças relacionadas à idade que podem ser responsáveis ​​pela capacidade do vírus de obter acesso ao sistema nervoso central (SNC) e/ou causar danos no SNC. A compreensão dessas diferenças pode fornecer caminhos para a prevenção ou tratamento da encefalite por LACV.

A barreira hematoencefálica (BHE) é uma barreira seletivamente permeável que desempenha um papel importante na inibição do acesso de patógenos ao SNC. A barreira hematoencefálica (BHE) é composta principalmente por células endoteliais capilares cerebrais (BCECs) com astrócitos vizinhos, membrana basal e pericitos, que interagem com os neurônios circundantes e a microglia para formar a unidade neurovascular4. A permeabilidade seletiva através dos BCECs é definida por vários transportadores e proteínas transportadoras, juntamente com a junção apertada (TJ), junção aderente (AJ) e junção comunicante (GJ) (coletivamente proteínas de junção celular (CJ))5,6. A integridade da BHE é fortalecida durante o desenvolvimento7,8. Atinge seu pico na idade adulta e depois enfraquece gradualmente com a idade devido à expressão reduzida da proteína CJ e comprometimento funcional dos transportadores9,10.

A patologia observada da encefalite LACV indica quebra substancial do BBB. A análise de imuno-histoquímica (IHC) de biópsias cerebrais de pacientes com LACV mostra manguitos mononucleares perivasculares com agregados focais de células imunes11, e estudos adicionais demonstraram lesão vascular induzida por encefalite LACV12. Assim, a encefalite por LACV está intimamente associada a patologias e anormalidades neurovasculares.

Observa-se uma encefalite e patologia vascular por LACV dependentes da idade no modelo de camundongo C57BL/6. Camundongos desmamados (~ 3 semanas de idade) são altamente suscetíveis à infecção por LACV do SNC e desenvolvem doença clínica após infecção periférica (intraperitoneal, IP) ou direta do SNC (intracerebral, IC). Em contraste, camundongos adultos ≥6 semanas de idade são resistentes à infecção periférica (IP), mas são suscetíveis à infecção direta do SNC (IC)13,14,15. Assim, há uma clara diferença relacionada à idade na capacidade do LACV de obter acesso ao SNC após infecção periférica.

Estudos sobre a suscetibilidade relacionada à idade mostram aumento do vazamento vascular e quebra do BBB em camundongos jovens após infecção por LACV. Embora os BCECs infectados com LACV não sejam prontamente observados in vivo, a quebra do BBB é mediada pelo vazamento especificamente através dos microvasos/BCECs na região do bulbo olfatório (OB)/núcleo olfatório anterior (AON), mas não no córtex (CT ) região16. O vazamento viral geralmente atinge o pico em 3 dias pós-infecção (dpi) e a infecção viral de neurônios é observada em regiões associadas a esse vazamento vascular. Em um estudo anterior, demonstramos que uma resposta específica da idade dos microvasos cerebrais/BECCs causa efeitos citopáticos diferenciais e suscetibilidade ao LACV. Além disso, usando fragmentos de microvasos cerebrais isolados ex vivo e culturas in vitro de BCECs primários isolados de camundongos desmamados e adultos, mostramos que os BCECs desmamados são mais propensos à infecção por LACV, formação de agregados semelhantes a sincícios e morte celular espectador17. As respostas de BCEC podem ser controladas por vários fatores, incluindo a resposta imune do hospedeiro, sobrevivência celular, expressão de proteínas CJ funcionais, manutenção de vasos sanguíneos ou por interações multigênicas. A identificação de fatores que diferem entre microvasos/BECs cerebrais de desmame e adulto durante a infecção por LACV pode fornecer informações sobre os fatores que são críticos na prevenção da neuroinvasão do LACV.

6weeks old mice that had mixed deficiency genotypes for Efna2, Efna3 and Efna5 (Efna2−/− mixed; abbreviated as Efna2−/− (m)), as detailed in Supplementary Table 3. All mice were distributed in two groups: homozygous for Efna2 deficiency with mixed +/+, +/− or −/− genotypes for Efna3 and Efna5 (Efna2−/− (m) or heterozygous for Efna2 deficiency with mixed +/+, +/− or −/− genotypes for Efna3 and Efna5 (Efna2+/− (m)) as well as wildtype mice with Efna2+/+3+/+5+/+ genotype (wildtype, abbreviated as WT). Following inoculation of 105 PFU/mouse, approximately 50% of Efna2−/− (m) mice developed neurologic disease, regardless of their Efna3 or Efna5 genotype (Supplementary Table 3). In contrast, most of the WT or Efna2+/− (m) mice (~91%) did not show any signs of neurological disease (Fig. 4b). We also observed high levels of virus in the Efna2−/− (m) mice with clinical (C) neurological disease versus non-clinical (NC) mice (Fig. 4c). Thus, Efna2 appears to have an inhibitory role in LACV pathogenesis in vivo (Fig. 4b, c)./p> 6 weeks old) WT and Efna2−/−3+/+5+/+ mice (Efna2 single knockout (KO); abbreviated as Efna2−/−(s)). As expected, the adult WT mice were not susceptible to a 105 PFU/mouse LACV dose (~96% non-neurologic). In contrast, approximately 38% of adult Efna2−/− (s) mice developed neurological disease in response to LACV infection (Fig. 5a). Furthermore, microvessel fragments isolated from Efna2−/−(s) mice had higher levels of LACV infection compared to WT at 24 and 48 hpi (Fig. 5b, d) and reduced survival at 72 and 96 hpi (Fig. 5c). We also examined vascular leakage in vivo using fluorospheres in WT and Efna2−/− (s) mice using a slightly later timepoint of 5 dpi. WT adult mice showed no vascular leakage, while Efna2−/− (s) mice had consistent detection of 1–3 fluorescent bead foci in the brain parenchyma (Fig. 5e, 5 out of 7 mice). Thus, Efna2−/− (s) mice were more susceptible to LACV-induced neurological disease, which correlated with an increase in vascular leakage in the CNS prior to disease onset. This also correlated with increased virus infection and decreased cell survival in Efna2−/− (s) BCECs compared to WT BCECs (Fig. 5b, c). Collectively, these data indicate an important role for Efna2 in BBB integrity during LACV infection./p> 6 weeks old) mice were treated with 100 ug of Poly I:C (HMW) diluted in a 0.5 mg/mL LyoVec transfection reagent solution (Invivogen) via a 100 ul retroorbital (IV) injection. LyoVec reagent was reconstituted using the provided deionized sterile water per the manufacture's recommendations and was used alone as the vehicle control. Microvessel fragments were removed from treated and vehicle animals at 3 h post injection. For comparison of OB versus CT microvessel fragment transcript expression from LACV and mock infection conditions, C57BL/6 weanling mice were infected with a 2000 PFU IP dose of LACV diluted into 200 ul of sterile, pharmaceutical grade PBS. Mock mice received an equivalent volume of uninfected Vero supernatant diluted in PBS. Microvessel fragments from OB and CT were isolated from LACV and mock infected mice at 3 dpi. RNAs were extracted from microvessel fragments as described below and purified using Agencourt RNAClean XP beads (Beckman Coulter, Brea, CA). RNA concentration was measured using RiboGreen fluorescent RNA quantification method (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). RNA purity and integrity was assessed using Nanodrop 8000 UV spectrophotometry (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA) and the Bioanalyzer RNA 6000 Pico chip assay (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), respectively. Sequencing libraries were generated from 115 ng (Adult/Weanling) or 170 ng (OB/CT) RNA using the TruSeq Stranded mRNA sample preparation kit, according to the manufacturer's recommended protocol (Illumina, Inc., San Diego, CA). Final, purified TruSeq libraries were quantified using the Kapa SYBR FAST Universal qPCR kit for Illumina sequencing (Kapa Biosystems, Wilmington, MA), diluted to 2 nM, and pooled equally. Libraries were sequenced on the HiSeq 2500 instrument using the TruSeq Rapid PE Cluster kit and Rapid 200 cycle SBS kit (Illumina, Inc., San Diego, CA)./p> 6 weeks) were inoculated IP with 105 PFU. Mock inoculated mice were inoculated with 200 ul of PBS with the appropriate amount of cell supernatant from uninfected Vero cells to match the volume for virus dilutions. The whole brains or OB-CT regions were isolated separately from LACV and mock inoculated mice at 3 dpi. Supplementary Table 4 represents abbreviation of most of the experimental groups and other nomenclatures used throughout this manuscript./p>